一、PM小鼠模型構(gòu)建技術(shù)路線選擇

二、PM小鼠模型構(gòu)建CRISPR-HDR方案（當(dāng)前常用）

1. 靶點設(shè)計與工具選擇

• gRNA設(shè)計：

• 靶向突變位點附近（距離<10 bp），使用Benchling優(yōu)化特異性。

• 推薦工具：

• 單堿基編輯：ABE8e（A→G）或BE4max（C→T）編輯器。

• HDR修復(fù)：高保真Cas9（如HiFi Cas9） + 化學(xué)修飾ssODN供體。

2. ssODN供體設(shè)計

5'同源臂 40-60nt

目標(biāo)突變+沉默突變*

3'同源臂 40-60nt

• 沉默突變：在PAM序列或gRNA靶區(qū)引入1-2      bp沉默突變（防止供體重切）。

• 化學(xué)修飾：3'端硫代磷酸酯化（增強穩(wěn)定性，IDT可合成）。

3. 受精卵注射

• 注射混合物：

• Cas9 mRNA (50 ng/μL) + gRNA (25 ng/μL) + ssODN (100 ng/μL)。

• 胚胎處理：

• 注射后培養(yǎng)至囊胚期，移植至假孕母鼠。

4. 基因型鑒定

• 初篩PCR：擴增含突變位點的片段（引物距突變位點>50 bp）。

• 深度測序：

• 使用ICE工具分析NGS數(shù)據(jù)，計算HDR效率。

• 敏感方法：ddPCR檢測低頻突變（<1%）。

5. 品系建立與驗證

• 傳代驗證：F0可能為嵌合體，需與野生型交配獲得穩(wěn)定遺傳。

• 功能驗證：

• 蛋白質(zhì)印跡（檢測突變蛋白表達(dá)）。

• 酶活檢測（如代謝酶突變需測活性）。

三、ES細(xì)胞打靶方案（超高精度）

1. 靶向載體構(gòu)建

• 同源臂設(shè)計：5'和3'臂各1.5-2 kb，中間含目標(biāo)突變。

• 篩選標(biāo)記：

• 正選擇：NeoR（后續(xù)可通過Flp刪除）。

• 負(fù)選擇：DTA（減少隨機整合）。

2. ES細(xì)胞篩選與驗證

• 陽性克隆鑒定：

• 長片段PCR（擴增整個重組區(qū)域）。

• Sanger測序確認(rèn)突變位點。

3. 小鼠制備

• 通過囊胚注射獲得嵌合體，與Flp deleter小鼠交配刪除NeoR。

四、Base Editing方案（無DSB風(fēng)險）

1. 系統(tǒng)選擇

• C→T突變：用BE4max + gRNA（靶向C在窗口4-8位）。

• A→G突變：用ABE8e + gRNA（靶向A在窗口4-7位）。

2. 效率優(yōu)化

• 注射濃度：

• BE4max mRNA (100 ng/μL) + gRNA (50 ng/μL)。

• 胚胎基因型：

• 需檢測旁系編輯（預(yù)測工具：BE-Hive)。

五、經(jīng)典案例解析

六、常見問題與解決