1. KO first小鼠模型構建方法

KO first（Conditional Ready）小鼠模型是一種多用途的基因敲除模型，通過在目的基因的特定位置插入特定的重組位點（如LoxP和FRT），實現全基因敲除或條件性基因敲除。以下是構建KO first小鼠模型的主要步驟：

設計靶向載體：在目的基因的外顯子兩側插入方向相同的LoxP位點，并在靶片段5’端內含子中插入一個帶有FRT位點的SA-IRES-reporter片段。這個片段包含一個報告基因（如GFP）和一個抗性基因（如Neo）。

構建Flox小鼠：通過同源重組技術，將靶向載體導入胚胎干細胞（ES細胞）中，然后將這些細胞注射到囊胚中，形成嵌合體小鼠。通過交配，獲得攜帶LoxP位點的Flox小鼠。

全基因敲除：將Flox小鼠與全身表達Cre的小鼠交配，Cre重組酶會識別LoxP位點并切除目標基因，同時保留報告基因和抗性基因，得到全基因敲除的小鼠。

條件性基因敲除：將Flox小鼠與Flp工具鼠交配，Flp重組酶會識別FRT位點并切除SA-IRES-reporter片段，得到常規的Flox小鼠。然后將Flox小鼠與組織特異性的Cre工具鼠交配，實現條件性基因敲除。

2. 基因型鑒定

PCR鑒定：通過設計特異性引物，對小鼠基因組DNA進行PCR擴增，檢測LoxP位點、FRT位點、報告基因和抗性基因的存在。

Southern blotting：通過限制性酶切和探針雜交，檢測基因整合情況和敲除情況。

3. 應用：具有廣泛的應用，主要包括以下幾個方面：

研究基因功能：通過全基因敲除或條件性基因敲除，研究基因在特定組織或發育階段的功能。

疾病模型構建：模擬人類疾病的發生發展，研究疾病機制。例如，通過敲除腫瘤抑制基因構建腫瘤模型。

藥物篩選和驗證：評估藥物的療效和安全性，驗證藥物靶點的有效性。

基因表達示蹤：通過報告基因的表達，示蹤目標基因的表達情況，方便基因研究。

4. 優勢與局限性

優勢：多用途：既可以實現全基因敲除，也可以實現條件性基因敲除。

靈活性：通過選擇不同的Cre和Flp工具鼠，可以靈活地控制基因敲除的時間和空間。

局限性：設計復雜：需要對基因進行全面分析，避免基因敲除導致內源性基因表達下調或截短蛋白的表達。

周期較長：構建過程涉及多個步驟，包括ES細胞打靶、嵌合體小鼠的獲得和交配等，整個過程可能需要9-12個月。